福建农林大学园艺学院/茶学福建省普通高校重点实验室林秋香等,通过测定白毫银针茶汤干预前后细胞的甘油三脂(TG)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力水平、丙二醛(MDA)含量变化,油红染色,分析细胞内SREBP-1c、FAS和CPT1AmRNA表达变化,评价白毫银针水提取物对非酒精性脂肪肝氧化应激的干预作用,以期阐明其防治非酒精性脂肪肝的作用机制。
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非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征,与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。随着肥胖及其相关代谢综合征全球化的流行趋势,非酒精性脂肪性肝病现已成为欧美等发达国家和我国富裕地区慢性肝病的重要病因,普通成人NAFLD患病率10%~30%,其中10%~20%为NASH,后者10年内肝硬化发生率高达25%。——科普中国
目前,NAFLD的发病机制被广为接受的是“二次打击”学说。该学说认为“第一次打击”是由胰岛素抵抗、肥胖等因素引起的。而启动“第二次打击”的因子主要包括氧化应激、脂质过氧化、促炎症因子、线粒体功能障碍等。
“第二次打击”理论认为,在脂肪变性的基础上,以反应氧体系为核心的氧应激、脂质过氧化及炎性细胞因子的作用可导致脂肪变性肝细胞发生炎症、坏死和纤维化,使肝脏进一步损害,而抗氧化剂能减小肝脏损伤程度。
据研究,白茶抗氧化能力在六大茶类中居于前列。因白茶加工工艺只有萎调和干燥,未经过剧烈的机械损伤和热的破坏,自由基含量最低。
重要的是白茶生产过程中,茶多酚虽然氧化,但其缓慢氧化形成的黄酮物质明显增加,白茶黄酮含量7.32~12.82mg·g-1,黄酮含量比鲜叶升高16.2倍。白茶氨基酸含量是其他五大茶类的1.13~1.25倍,咖啡碱含量高14%~29%,而茶多酚、黄酮类物质、氨基酸、咖啡碱对茶浸提液抗氧化能力有重要影响。
试验证明,白毫银针水提取物能减轻非酒精性脂肪肝模型组肝细胞TG蓄积、降低细胞内MDA含量、升高SOD活性,其机制可能与抑制SREBP-1c及其下游的FAS基因表达,减少TG合成,且增强CPT1A基因表达,加速TG分解有关。
各组细胞内SOD、MDA、TG含量的变化
A.正常组;B.自然恢复组;C.模型组;D.辛伐他汀组;E.油酸处理24h,1mg·mL-1白毫银针茶汤处理24h;F.油酸处理24h,0.5mg·mL-1白毫银针茶汤处理24h;G.1mg·mL-1白毫银针茶汤处理24h,油酸处理24h;H.0.5mg·mL-1白毫银针茶汤处理24h,油酸处理24h。
由图可知,模型组(非酒精性脂肪肝细胞模型)与正常组相比,模型组细胞内超氧化物歧化酶SOD含量显著降低;茶汤处理组(E、F、G与H)和辛伐他汀(降血脂药物)处理组(D)SOD含量显著高于模型组;茶汤处理组、辛伐他汀组与自然恢复组比较,D、E组SOD含量均显著高于自然恢复组。
从丙二醛MDA含量来看,模型组细胞(非酒精性脂肪肝细胞模型)是正常组的3倍多;茶汤处理组、辛伐他汀(降血脂药物)处理组的MDA含量均显著低于模型组;茶汤处理组E、F、G和辛伐他汀组MDA含量也显著低于自然恢复组。
模型组细胞(非酒精性脂肪肝细胞模型)甘油三脂TG含量是正常组的5倍多;模型组与茶汤处理组、辛伐他汀(降血脂药物)处理组相比,D、E、F、G组TG含量均显著低于模型组;茶汤处理组E、G和辛伐他汀组的TG含量均显著低于自然恢复组。
02
各组细胞油红O染色
A.0.5mg·mL-1白毫银针处理24h,油酸处理24h;B.1mg·mL-1白毫银针处理24h,油酸处理24h;C.油酸处理24h,0.5mg·mL-1白毫银针处理24h;D.油酸处理24h,1mg·mL-1白毫银针处理24h;E.辛伐他汀组;F.自然恢复组;G.模型组;H.正常组。
利用倒置显微镜观察油红染色后的细胞,结果如图。模型组(G)与其余各处理组相比,细胞内橘红色脂滴数量最多,部分出现片状融合现象;D组细胞橘红色脂滴数量最少。由模型组G与自然恢复组F相比可知,脂肪肝细胞具有自我修复能力,脂滴数量在一定程度上减少,且脂滴颜色褪去。
03
各组细胞内SREBP-1c、FAS和CPT1AmRNA表达变化
A.正常组;B.自然恢复;C.模型组;D.辛伐他汀组;E.油酸处理24h,1mg·mL-1白毫银针茶汤处理24h;F.油酸处理24h,0.5mg·mL-1白毫银针茶汤处理24h;G.1mg·mL-1白毫银针茶汤处理24h,油酸处理24h;H.0.5mg·mL-1白毫银针茶汤处理24h,油酸处理24h。
正常组与模型组相比,模型组(非酒精性脂肪肝细胞模型)SREBP-1c表达显著上调;茶汤处理组(E、F、G与H)、辛伐他汀处理组(D)的SREBP-1c表达显著下调;辛伐他汀处理组(D)和E、F、G茶汤处理组SREBP-1c表达量均显著低于自然恢复组(B)。此外,E茶汤处理组SREBP-1c表达量显著低于辛伐他汀(降血脂药物)处理组(D)。
FAS表达模式与SREBP-1c相似,不同之处在于辛伐他汀处理组(D)和茶汤处理组(E、F、G与H)FAS表达量均显著低于自然恢复组(B);E、G与H茶汤处理组FAS表达量均显著低于辛伐他汀处理组(D)。
CPT1A表达模式与以上两个基因基本相反。茶汤处理组(E、F、G、H)和辛伐他汀处理组的CPT1A表达均显著高于模型组;辛伐他汀处理组和E、G茶汤处理组CPT1A表达显著高于自然恢复组。
讨论
氧化应激与非酒精性脂肪性肝病的发生密切相关。氧化应激会引起不同程度的肝损伤。
由自由基攻击细胞膜磷脂分子引发脂质过氧化反应而产生的MDA具有一定的细胞毒性。
同时,肝细胞MDA含量常被作为评判细胞内脂质过氧化严重程度的重要指标,如肝细胞MDA含量上升,则表明发生了一定程度的脂质过氧化反应,且有可能进一步引发氧化应激反应。
细胞在油酸的刺激下产生大量的MDA等有害物质破坏其完整性,而SOD作为氧自由基的清除剂,其活性增强可减弱细胞损伤,从而起到保护细胞的作用。
本研究中,模型组与正常组比较,细胞内MDA显著升高,而细胞内SOD活力显著降低;茶汤处理组(E、F、G与H)和辛伐他汀处理组(D)SOD含量显著高于模型组,而MDA含量显著低于模型组,其中E组SOD活性较高,而MDA含量最低,且根据油红染色图可知,E组脂滴数量少。可知1mg·mL-1白毫银针水提取物可显著改善肝脏脂质积累。
在油酸的刺激下,细胞脂肪酸的摄取和合成量超过其分解代谢速度,脂质被储存在肝细胞中,并可能导致肝细胞积累大量甘油三酯(TG)。积累TG的肝细胞内氧自由基增多,当积累量超过肝脏氧化能力时,则加剧脂质积累和细胞代谢紊乱,进而造成细胞损伤。
在NAFLD患者中,肝脏SREBP-1c表达升高。SREBP-1c是控制肝脏脂质合成的重要转录因子,促使肝脏脂肪酸合成增加而消耗减少,导致肝脏内脂质累积。SREBP-1c可促进下游FAS等生脂基因的表达,增强脂肪酸合成,加速TG积累,在肝脏TG合成中发挥重要作用。CPT1A是将脂肪酸从细胞质转运至线粒体基质的膜转运蛋白,参与线粒体β氧化,加速脂肪酸分解。
本研究中,1mg·mL-1白毫银针水提取物能显著改善肝脏脂质积累,且作用机制可能是通过抑制脂质合成有关基因SREBP-1c和FAS的表达,抑制TG合成;上调脂肪酸β氧化基因CPT1A,加速TG分解,从而缓解脂肪肝细胞模型中TG堆积。
参考文献:林秋香,等:白毫银针茶水提取物对LO2细胞脂质积累的影响及其机理研究
来源:华茶号
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